Reklama:

TECHNOLOGIE

"Stało się przeraźliwie oczywiste, że technologie wyprzedziły już nasze człowieczeństwo."
-
 Albert Einstein

Metody identyfikacji genetycznej, badań ojcostwa i pokrewieństwa

 
Metody genetyczne

Podstawą badań zmienności genetycznej a tym samym ustalania zgodności pokrewieństwa lub też jej braku jest polimorfizm DNA a więc różnice osobnicze w sekwencji DNA między poszczególnymi osobami. Zmiany w DNA, których częstość występowania w populacji jest mniejsza niż 1% nazywane są już mutacjami (nie polimorfizmem).
 
Rodzaje polimorfizmów DNA - podział wg sekwencji polimorficznych 

Szacuje się, że różnice w sekwencji DNA między ludźmi stanowią ok. 0,1-0,2% genomu, co odpowiada mniej więcej 10 milionom zmian (różnic) typu SNP. Zmiany SNP polegające na podstawieniu (substytucji) nukleotydów stanowią większość zmienności DNA między ludźmi, niemniej w badaniach pokrewieństwa wykorzystuje się również polimorfizmy polegające na występowaniu alleli o różnej liczbie występujących po sobie powtórzeń identycznej sekwencji (polimorfizm mini- oraz mikrosatelitarny). 

·  polimorfizm SNP – najczęściej spotykany polimorfizm pojedynczego nukleotydu (ang. Single Nucleotide Polymorphism); drobne zmiany w badanej sekwencji typu: substytucja (podstawienie nukleotydu), delecja (usunięcie nukleotydu), insercja (wstawienie dodatkowego nukleotydu),

·    polimorfizm minisatelitarny; 7-100 par zasad w powtórzeniu, 2-kilkaset powtórzeń w pojedynczym locus; Zalety: największa heterozygotyczność i wartości współczynników decydujących o przydatności tych polimorfizmów w badaniach sądowych; Wady: czasochłonne metody badań, wynik badania mocno uzależniony od doświadczenia laboranta, 

·   polimorfizm mikrosatelitarny; 1-6 par zasad w powtórzeniu; 5-100 powtórzeń, polimorfizm najczęściej wykorzystywany obecnie w badaniach ojcostwa, Zalety: pewne fenotypowanie, porównywalne częstości alleli w populacji, szybka i zautomatyzowana metodyka badań uniezależniająca wynik badania od biegłości laboranta; łączna ocena 9-13 loci mikrosatelitarnych (zwykle bada się 15-16 loci) równoważy pewność uzyskiwanych wyników przy analizie 5-6 loci mini satelitarnych,

Rozdzielczość a tym samym dokładność i pewność dostępnych metod genetycznych jest różna i zależy zarówno od sumarycznej liczby badanych układów polimorficznych (miejsc na DNA, loci) jak również liczby i częstości występowania odmiennych wariantów alleli w populacji (np. Kaukaskiej) w poszczególnych układach. Upraszczając, dokładność metody jest wprost proporcjonalna do liczby badanych układów (loci) oraz liczby dostępnych w populacji alleli (wersji tego samego genu) obserwowanych u różnych ludzi w tych układach.
 
Analiza polimorfizmu – podział wg liczby badanych miejsc (loci)

  • Analiza jednopunktowa – SLP (ang. Single Locus Polymorphism) – ocena różnicy w miejscu/odcinku jednego locus, występującego na dwóch chromosomach homologicznych, po jednym pochodzącym od ojca i matki badanej osoby,

  • Analiza wielopunktowa – MLP (ang. Multi Locus Polymorphism)
 
Techniki analizy polimorfizmu genetycznego

  • Technika analizy restrykcyjnej; rodzaj badanego polimorfizmu: sekwencje minisatelitarne, zastosowanie: badanie polimorficznych fragmentów DNA o dużym zróżnicowaniu wielkości (od 1 tysiąca do kilku tysięcy par zasad); analiza jednopunktowa – SLP,

  • Technika hybrydyzacji; rodzaj badanego polimorfizmu: sekwencje minisatelitarne, zastosowanie: badanie polimorficznych fragmentów DNA o dużym zróżnicowaniu wielkości (od 1 tysiąca do kilku tysięcy par zasad), analiza jednopunktowa – SLP np. locus: D7S21, sonda MS31,

  • Technika AmpFLP (ang. Amplification Length Polymorphism), polegająca na powieleniu polimorficznych fragmentów metodą PCR, rozdzieleniu ich na żelu poliakrylamidowym z drabiną alleli oraz wybarwieniu metodą srebrową; rodzaj badanego polimorfizmu: sekwencje minisatelitarne, zastosowanie: badanie polimorficznych fragmentów DNA o wielkości poniżej 1 tys. par zasad; analiza jednopunktowa – SLP, np.: locus D1S80,

  • Technika hybrydyzacji produktów PCR z im mobilizowanymi sondami oligonukleotydowymi, specyficznymi dla poszczególnych alleli, np.: analizy genów struktury HLA DQalfa,

  • Multipleksowa technika PCR – obecnie najczęściej stosowana technika w badaniach ojcostwa - obejmuje jednoczesną analizę kilku do kilkunastu loci sekwencji mikrosatelitarnych (zwykle 15-16 układów STR, o długości od 100-400 par zasad); metoda polega na jednoczesnym powieleniu polimorficznych fragmentów w jednej probówce PCR, rozdzieleniu ich na sekwenatorze (automatycznym sekwenserze) z drabiną alleli oraz porównaniu biostatystycznym uzyskanych wyników analizy wielopunktowej – MLP. Zasada rozdziału: droga migracji znakowanych fluorescencyjnie fragmentów DNA (alleli w układach STR) w trakcie elektroforeza|elektroforezy (np. kapilarnej w sekwenatorze) o zadanych parametrach (napięcie, siła jonowa buforu, temperatura, usieciowanie żelu) jest odwrotnie proporcjonalna do logarytmu z wielkości (długości) rozdzielanych fragmentów (im dłuższy allel tym wolniej jest rozdzielany w żelu). Ustalanie wielkości fragmentów i numeryczne oznaczenie alleli poszczególnych układów STR wymaga użycia drabiny alleli – czyli wzorca z wszystkimi występującymi w populacji wariantami alleli, rozdzielanymi równocześnie z próbkami badanego ojcostwa,

  • Technika mikromacierzy SNP – jednoczesna analiza kilku tysięcy loci typu SNP; technologia wysokorozdzielcza; z powodu wysokiego kosztu badań nie znajduje nadal powszechnego zastosowania,

  •  Sekwencjonowanie genomowe – odczyt całej sekwencji DNA człowieka, w tym wszystkich możliwych polimorfizmów i mutacji; technologia najbardziej dokładna, niemniej niedostępna jeszcze dla badań rutynowych z powodu wysokiego kosztu analiz (kilkadziesiąt -kilkaset tysięcy PLN/próbkę);

Typy analizowanego polimorfizmu genetycznego

  • Analiza polimorfizmu typu SNP. Polimorfizmy te stanowią ok. 90% całej zmienności występującej w ludzkim genomie (ok. 3 mld nukleotydów) i występują co ok. 100-300 nukleotydów. W przypadku polimorfizmu SNP, mimo możliwości badania ogromnej ilości zmiennych miejsc (loci) typu SNP na genomowym DNA (ok. 10 milionów), maksymalna liczba dostępnych alleli dla pojedynczego miejsca to zaledwie 4, co w uproszczeniu odpowiada możliwości substytucji tylko jednego z czterech nukleotydów A, G, C lub T. Niski współczynnik dyskryminacji metod opartych o badania SNP można jednak będzie w przyszłości istotnie poprawić wraz z rozwojem technologii analitycznych, rekompensujących małą zmienność alleli SNP (A, G, C, T) możliwością oznaczania większej liczby badanych loci (ok. kilkudziesięciu), przy zachowaniu niskiej ceny badania. SNP przewyższa inne typy polimorfizmów możliwością wykazywania podstruktur populacyjnych zarówno w badaniach sądowych jak i genealogicznych. Niestety koszty tego typu badań na podniesionym poziomie rozdzielczości (np. mikromacierze SNP, DNA-chip) są nadal wysokie, co ogranicza ich powszechne zastosowanie. 

  • Analiza mirkosatelitarnych układów STR chromosomów somatycznych. Najbardziej rozpowszechnione są obecnie metody oparte o analizę układów STR (sekwencji mikrosatelitarnych)- innego typu polimorfizu, polegającego na występowaniu w populacji alleli o zmiennej liczbie (5-100) powtórzeń tandemowych zbudowanych od 1 do 6 nukleotydów (np. (CATG)n lub (CA)n), rozłożonych równomiernie co 6-10 tys. par zasad. Różne allele układów STR występują zwykle w populacji w liczbie od kilku do kilkunastu, co znacznie zwiększa zdolności rozdzielczą tych metod w porównaniu z analizą zmienności SNP, przy badaniu tej samej liczby układów (loci). W genomie człowieka znajduje się ok. 100 tys. loci z tym typem sekwencji, w większości specyficznych dla człowieka i zlokalizowanych najczęściej w sekwencjach flankujących geny oraz intronach (obszarach niekodujących). W badaniach ojcostwa wykorzystuje się wybrane sekwencje mikrosatelitarne, które charakteryzuje duża liczba alleli w populacji (wysoki współczynnik dyskryminacji) oraz stosunkowo mała długość całkowita (100-400 par zasad). Technologie analizy układów STR umożliwiają obecnie badanie 15-16 loci występujących na chromosomach somatycznych (nie płciowych) oraz markera płci (amelogeniny) w jednej reakcji multipleksowego PCR, co umożliwia uzyskanie wyniku wykluczenia ojcostwa ze 100% pewnością lub potwierdzenie ojcostwa z co najmniej 99,999% pewnością. Proces technologiczny obejmuje zwykle: 1) pobranie materiału biologicznego (najczęściej wymazu z jamy ustnej), 2) izolację i oczyszczanie DNA, 3) amplifikację (powielenie) układów STR na matrycy wyizolowanego DNA (zwielokrotnienie liczby kopii wybranych fragmentów DNA z 1 do ok. biliona), 4) rozdział wyznakowanych fluorescencyjnie fragmentów DNA (STR) na sekwenatorze (zwykle kapilarnym), 5) analiza porównawcza uzyskanych profili DNA, 6)analiza statystyczna, 7) wydanie ekspertyzy. 

  • Analiza mikrosatelitarnych układów STR chromosomu Y. Badanie ojcostwa z wykorzystaniem układów STR chromosomu Y jest bardzo podobne do powyżej przedstawionej technologii oznaczania alleli STR chromosomów somatycznych, różnica polega jednak na amplifikacji różnych układów (zwykle 17-loci), występujących wyłącznie na chromosomie Y męskiego DNA. Technologia ta ma szczególne zastosowanie w badaniu pokrewieństwa w linii męskiej (np. dziadka i wnuka lub braci) jak również kryminalistyce (w oskarżeniach o gwałt) w tym w wykrywaniu śladów spermy i ustalaniu męskiego profilu DNA w wymazach z pochwy, gdzie dominuje DNA żeńskie (nie posiadające chromosomy Y). Z drugiej strony, genotypowanie układów STR chromosomu Y wykorzystywane jest w „testach zdrady” kobiet, gdzie obecność chromosomu Y na bieliźnie damskiej może wskazywać na współżycie kobiety z osobą trzecią, zwykle mężczyzną innym niż małżonek. Niemniej w tego typu badaniach wykonuje się dodatkowe analizy w tym biochemiczne testy na spermę i porównuje profile STR chromosomu Y (np. profil męża i profil innego mężczyzny oznaczonego na podstawie mikrośladu zdjętego z bielizny kobiety). Układy STR chromosomu Y wykorzystywane są również powszechnie do budowania genetycznych drzew genealogicznych w linii męskiej, uzupełniając tym samym możliwości wyznaczania genealogii rodzin w linii żeńskiej na podstawie analizy mitochondrialnego DNA. 

  • Analiza mikrosatelitarnych układów STR chromosomu X. Badanie pokrewieństwa z wykorzystaniem układów STR chromosomu X jest również podobne do technologii oznaczania alleli STR chromosomów somatycznych, różnica jednak polega na amplifikacji różnych układów (zwykle 17-loci), występujących wyłącznie na chromosomie płciowym X. Technologia ta znajduje zastosowanie w ustalaniu pokrewieństwa między domniemanym ojcem i córką (jeśli nie ma możliwości zbadania wystarczającej liczby układów somatycznych), badaniu pokrewieństwa między rodzeństwem: mężczyzną i kobietą (wspólny chromosom X), nieżyjącym ojcem a żyjącą córką na podstawie DNA żyjących sióstr zmarłego ojca, w układach wielopokoleniowych jak również w kryminalistyce. 

  •  Analiza polimorfizmu sekwencji mini satelitarnych. Metoda polega na jednoczesnym badaniu fragmentów nadzmiennych regionów minisatelitarnych DNA, pochodzących z różnych miejsc różnych chromosomów, co nazwane zostało analizą wielopunktową polimorfizmu MLP (ang. Multi Locus Polymorphism) lub typu odcisku palca (ang. DNA fingerprint) w związku z otrzymywaniem unikatowego wzoru fragmentów DNA, porównywanym z indywidualnym wzorem linii papilarnych). Szacuje się, że w genomie występuje ok. kilku tysięcy loci zawierających sekwencje minisatelitarne, skumulowane głównie w telomerowych regionach chromosomów, zawierające od 7-100 par zasad w jednym powtórzeniu i ok. 2- do kilkuset uporządkowanych kolejno powtórzeń w jednym loci. Poziom mutacji w sekwencjach mini satelitarnych jest bardzo wysoki i wynosi ok. 5% dla locus D1S7. Wymienione locus charakteryzuje się pulą ok. 2400 różnych alleli, i wysokim stopniem heterozygotyczności (99%) w populacji. Metoda opublikowana została w 1985r przez Jeffreysa, który stosując tylko jedną sondę molekularną uzyskał hybrydyzacje z kilkudziesięcioma fragmentami restrykcyjnymi różnej wielkości,

  • Analiza polimorfizmu długości fragmentów restrykcyjnych (RFLP). Najstarsza ze stosowanych w medycynie sądowej metod identyfikacji oraz badania pokrewieństwa. Pierwszy wieloalleliczny układ polimorficzny oznaczony tą metodą opisał Wyman i White w 1980r. Badanie wykonuje się techniką hybrydyzacji, co wymaga dużych ilości DNA (ok. 2-4ug) nie zdegradowanych cząsteczek DNA, co znacznie ograniczyło użyteczność tej metody w badaniu mikrośladów kryminalistycznych, 

  • Analiza polimorfizmu mitochondrialnego DNA mtDNA. Badanie pokrewieństwa z wykorzystaniem analizy sekwencyjnej mitochondrialnego DNA (mtDNA) polega na oznaczaniu polimorfizmów typu SNP w wysoce-zmiennych, niekodujących sekwencjach HVI oraz HVII. Technologia ta znajduje zastosowanie w ustalaniu pokrewieństwa w linii żeńskiej (babka-matka-córka) oraz budowaniu drzew genealogicznych na podstawie dostępnych baz sekwencji mtDNA i wykrytej zmienności mtDNA badanej osoby. Mitochondrialne DNA, dziedziczone jest z pokolenia na pokolenie w linii żeńskiej (syn dziedziczy mtDNA matki ale nie przekazuje go dalej swoim potomkom. Zarówno chromosom Y jak i mtDNA na przestrzeni wieków zmieniały się (mutowały): 1) wystarczająco powoli by zachować cechy charakterystyczne dla poszczególnych grup populacji odseparowanych od siebie przestrzennie przez kontynenty języki i zwyczaje, ale jednocześnie 2) wystarczająco szybko by móc ustalić pokrewieństwo współczesne między poszczególnymi osobami. W badaniach sądowych, z powodu niskiego współczynnika dyskryminacji loci SNP, mitochondrialne DNA wykorzystywane jest do identyfikacji genetycznej tylko w przypadku niewystarczającej ilości DNA genomowego (gDNA), zwłaszcza gdy doszło do widocznego zdegradowania materiału biologicznego. Liczba kopii poszczególnych układów STR w pojedynczej komórce wynosi 2 i odpowiada parze chromosomów, po jednym od ojca i matki, podczas gdy liczba kolistych cząsteczek mitochondrialnego DNA może dochodzić w pojedynczej komórce do kilku tysięcy. Fakt przewagi liczebnej kopii mtDNA nad gDNA w jednej komórce decyduje o wykorzystaniu mitochondrialnego DNA wtedy gdy genomowe DNA zostało zniszczone. Prawdopodobieństwo pozostania nienaruszonych kopii mtDNA w porównaniu z gDNA w zdegradowanym materiale biologicznym jest zatem wielokrotnie wyższe, co umożliwia wykonanie identyfikacji tam, gdzie standardowe metody analizy na genomowych układach STR nie odniosą skutku. 

  • Analiza polimorfizmu antygenowego krwinek czerwonych: ABO, RH, MNSs, FY, JK, Kell, LU, P – metody historyczne (koniec lat osiemdziesiątych ubiegłego wieku), rzadko obecnie wykorzystywane,

  • Analiza antygenów zgodności tkankowej HLA. Metoda historyczna, rzadko obecnie wykorzystywana do ustalania pokrewieństwa, chociaż nadal stosowana w badaniach zgodności tkankowej w transplantologii,

  • Analiza polimorfizmu genów białek surowicy: C3, PLG, GM, KM, HP, GC, TF, , BF, PI, 2HS, ORM, F13A, F13B – metody historyczne, rzadko obecnie wykorzystywane,
  • Analiza układó grupowych enzymów erytrocytarnych: AK, ACP, ESD, GPT, GLO, ADA, PGM, PGP, 6-PGD – metody historyczne, rzadko obecnie wykorzystywane,

Metody biochemiczne/immunochemiczne. 
Metody biochemiczne w badaniach pokrewieństwa stanowią jedynie metody pomocnicze, zwłaszcza w przypadku braku możliwości pobrania wystarczającej ilości DNA. Historycznie, jedną z takich metod było szacowanie możliwości wykluczenia ojcostwa na podstawie grup ABO krwi. Przykładem takiego wykluczenia mógł być pozwany domniemany ojciec z grupą krwi AB, dziecko z grupą 0 i matka z grupą 0. Testy biochemiczne mają jednak obecnie duże znaczenie w badaniach kryminalistycznych, w których zachodzi konieczność wykrywania spermy, śliny, krwi lub moczu na różnych materiałach dowodowych. 

Badanie ojcostwa metodą dowodzenia faktów historycznych przed sądem
Matka dziecka, po pozwaniu domniemanego ojca zobowiązana jest do przedstawienia faktów, które uprawdopodobniają ojcostwo wskazanego przez nią mężczyzny. Domniemany ojciec, jeśli nie uznaje powództwa za wiarygodne musi wykazać przed sądem że „niepodobieństwem jest, aby mógł być ojcem tego dziecka”. Sąd wydaje następnie [[orzeczenie sądowe|orzeczenie]], na podstawie ustawy, Kodeksu rodzinnego i opiekuńczego, uchwalonego w 1964r i znowelizowanego w 1975r (szczegółowe informacje poniżej, w podrozdziale „orzeczenie sądowe” działu „aspekty prawne”).

Metody badań dokumentacji historycznej
W niektórych przypadkach badań ojcostwa i pokrewieństwa nie ma możliwości pobrania materiału genetycznego np. z powodu braku śladów biologicznych osób zmarłych w odległym czasie. W takich przypadkach zachodzi konieczność przeprowadzenia badań dokumentacji historycznej na podstawie założonych hipotez i dostępnych materiałów (np. ksiąg parafialnych, dokumentacji organów samorządowych itp.). Należy pamiętać jednak, że dokumentacja historyczna nie stanowi jednoznacznego dowodu, potwierdzającego lub wykluczającego badane pokrewieństwo, może jednak uwiarygodnić założone hipotezy i uzupełnić inne, bardziej bezpośrednie metody badań.


Biostatystyka
Potwierdzenie lub wykluczenie ojcostwa, w zależności od zastosowanej metody, ustala się na podstawie obliczeń: 1) współczynnika dyskryminacji, 2) teoretycznej szansy wykluczenia ojcostwa, 3) średniego współczynnika ojcostwa. 
  • Współczynnik dyskryminacji (ang. Power of Discrimination, PD) – określa prawdopodobieństwo zróżnicowania dwóch niespokrewnionych osób w populacji na podstawie badań polimorficznego locus,
  • Teoretyczna szansa wykluczenia ojcostwa (ang. Power of exclusion, PE) określa prawdopodobieństwo wykluczenia nisłusznie pozwanego mężczyzny na podstawie wyników badań,
  • Średni współczynnik ojcostwa (ang. mean paternity index, MPI) określa średnią wartość współczynnika ojcostwa, jaką można uzyskać badając określony układ w grupie kilku domniemanych ojców. Współczynnik ojcostwa decyduje o prawdopodobieństwie ojcostwa.

Banki profili genetycznych
Większość najczęściej stosowanych w badaniu ojcostwa układów STR to układy które wchodzą w skład genetycznych profili osobniczych oznaczanych w USA w systemie CODIS oraz w Europie – system ENFSI. W Polsce nie istnieje zintegrowany system gromadzenia profili genetycznych jak również brak jest formalno-prawnych rozwiązań, odnoszących się do sposobów prowadzenia badania ojcostwa i pokrewieństwa. Stąd, polskie standardy pracy w tym zakresie opierają się głównie o wytyczne systemu ENFSI oraz CODIS. Międzynarodowa nomenklatura liczbowa alleli (numerycznie oznaczonych alleli) mini- i mikrosatelitarnych odzwierciedla liczbę powtórzeń sekwencji tandemowej oraz ich wielkość (długość).
·     System CODIS. Od 1990 w USA rozpoczęto budowanie bazy profili genetycznych, które od 1993r w ramach systemu CODIS (ang. Combined DNA index system) obejmują 13 układów STR oraz amelogeniny (markera płci): CSF1PO, D3S1358, D5s818, D7s820, D8S1179, D13s317, D16s539, D18s51, D21s11, FGA, THO1, TPOX, vWA, Amelogenina.
·      Europejski system organizacji ENFSI. W Europie, w ramach organizacji ENFSI (ang. European Network of Forensic Science Institutes DNA Working Group) budowana jest baza profili obejmujących 8 markerów STR, z których 7 pokrywa się z bazą CODIS.
·    Brytyjski system organizacji FSS. W Wielkiej Brytanii, od 1994r organizacja FSS (ang. Forensic Science Service) tworzy w oparciu o TGM (ang. Third Generation Multiplex) tworzy niezależną bazę danych profili genetycznych zbudowaną z 7 układów STR, z których tylko 1 pokrywa się z systemem CODIS, natomiast 2 układy z europejskim systemem ENFSI.
·      Bazy polimorfizmów mitochondrialnego DNA. Wiele prywatnych i publicznych jednostek na całym świecie gromadzi dane dotyczące profili genetycznych mtDNA, determinowanych zmiennością typu SNP. Zgromadzone dane, umożliwiając porównanie profilu badanej osoby z innymi profilami dostępnymi w bazie, znajdują powszechne zastosowanie w genealogii w linii żeńskiej.
·       Bazy polimorfizmów STR chromosomu Y. Dane dotyczą profili genetycznych opartych o układy typu STR, występujące na chromosomie Y. Zgromadzone dane umożliwiają porównanie profilu badanej osoby z innymi profilami dostępnymi w bazie, znajdując tym samym zastosowanie w genealogii w linii męskiej.


Prawo wobec tworzenia baz profili DNA. W większości krajów, gromadzenie danych bez wiedzy i zgody osób badanych jest zabronione, co wynika z Deklaracji Praw Człowieka. Stąd publiczne bazy danych tworzone są zwykle na podstawie profili genetycznych osób skazanych lub oskarżonych o dokonanie przestępstwa. W Polsce istnieją przepisy ograniczające zbieranie danych osobowych, co nie dotyczy jednak bezpośrednio cech genetycznych, identyfikujących daną osobę.
 

  Reklamy:

UA-49095250-1